Brza detekcija kontaminanata u vinu

U proizvodnji vina prisutni su različiti rodovi kvasca od kojih većina djeluje pozitivno na organoleptičke karakteristike vina kao što su miris, okus i boja, dok neki kvasci imaju negativan utjecaj. Kvasac Brettanomyces bruxellensis je glavni kontaminant crnog vina i pritom uzrokuje tzv. „Brett karakter“ vina, odnosno miris vina po konjskom znoju, mokroj vuni, štali itd. Također, uzrokuje gubitak boje crnih vina, stvaranje mutnoće i biofilma na površini vina te povećanje hlapive kiselosti vina. Prisutnost B. bruxellensis u crnom vinu je značajan problem u svim vinarskim regijama svijeta (npr. detektiran je u 19 – 59 % vina proizvedenih u Francuskoj i Portugalu). Jedan od izazova suvremenog vinarstva jest kontrola rasta i brza identifikacija ovog kvasca, čime bi se značajno smanjili ekonomski gubici jer se vino kontaminirano ovim kvascem smatra nepoželjnim za konzumaciju. Problem pravovremene identifikacije kvasca B. bruxellensis su njegove fiziološke i morfološke karakteristike. To je spororastući kvasac koji može određeno vrijeme provoditi u tzv. "viable but non-culturable“ obliku kada uzrokuje promjene u vinu, a pritom se ne može detektirati klasičnim mikrobiološkim metodama.

U zadnja dva desetljeća, tehnologije sekvenciranja postale su dovoljno pouzdane i pristupačne te se njihova upotreba proširila u mnoga područja znanosti i privrede. Pojavom tehnologije sekvenciranja treće generacije omogućena su znatno dulja očitanja što olakšava daljnju analizu. Jedna od njih je i tehnologija sekvenciranja nanoporama tvrtke Oxford Nanopore Technologies (ONT). Njihov uređaj za sekvenciranje MinION je jeftin (oko 1000 USD), malen i pogodan za rad na terenu te je prve rezultate u stanju proizvesti već za nekoliko sati.

Cilj ovog projekta je primijeniti uređaj za sekvenciranje MinION za brzu detekciju kvasca Brettanomyces bruxellensis u vinu. MinION je veličine pametnog telefona, spaja se na laptop preko USB priključka i koristi brzu vezu na Internet. Njegova prenosivost omogućuje sekvenciranje na terenu (u vinariji) što ubrzava postupak jer transport uzorka do laboratorija nije potreban. Sekvenciranje uzorka izravno iz vina smanjilo bi vrijeme pripreme i omogućilo istovremenu detekciju i drugih mikrobioloških kontaminanata. Rezultati sekvenciranja uređajem MinION dostupni su korisniku postupno, tijekom trajanja postupaka, što omogućuje prekidanje procesa čim se detektira željeni mikroorganizam. Ovim pristupom ubrzava se analiza, ali se smanjuju i troškovi jer se ćelija za sekvenciranje (engl. Flowcell) može ponovno upotrijebiti. Velika prednost sekvenciranja nad klasičnim metodama jest i mogućnost otkrivanja kvasca B. bruxellensis u „viable but non-culturable“ obliku.

Tijekom projekta razvit će se računalne metode koje će na temelju sekvenciranja uzorka iz vina, uz minimalnu predobradu, dati informacije o prisutnosti navedenog mikroorganizma u pojedinim uzorcima vina. Razvijene metode moći će se primijeniti na druge vrste uzoraka i na druge organizme te bi mogle imati široku primjenu.

Na projektu će sudjelovati članovi Laboratorija za bioinformatiku i računalnu biologiju Fakulteta elektrotehnike i računarstva (LBCB) i, kao partneri, članovi Laboratorija za tehnologiju i analitiku vina Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta. Zadatak članova LBCB-a biti će razvoj računalnih metoda kojima će se na temelju podataka dobivenih uređajem MinION detektirati postoje li u uzorku vina određeni kontaminanti. Na temelju razvijenih metoda kreirat će se prijenosni sustav za detekciju zasnovan na uređaju MinION i prijenosnom računalu, koji će se moći koristiti na terenu. Članovi Laboratorija za tehnologiju i analitiku vina bit će zaduženi za pribavljanje uzoraka i pripremu uzoraka za sekvenciranje.